Исследование возбудителя

Описание:

Автор: М. Н. Тыртычнай, К. Н. Фатьянов

Исследование возбудителя

В результате лабораторного исследования было установлено, что возбудитель болезни представляет подвижные бактерии — палочки с закругленными концами, размером 0,5 -0,9X0,8—1,6 мк с леретрнхпальными жгутиками. Рост, цвет и форма колоний в зависимости от состава питательных сред, температурного и светового режима и времени посева варьируют. На рыбопептонном агаре колонии в начальный период роста просматриваются через оптический прибор при небольшом увеличении бесцветными напоминающими мелкие росинки. По мере роста они приобретают белизну, а через сутки становятся белыми, с чуть заметным пожелтением в центре. Иногда от центра колонии образуются малозаметные лучи (радиально исходящие штрихи), которые к краю сливаются с общим фоном.

Отдельные колонии в результате последующего роста изменяют цвет и становятся светло-желтыми или желтоватыми. Колонии суточной культуры круглые, мелкие, с наибольшим диаметром в основании 0,4—0,5 м. Наиболее типичная объемная форма колоний напоминает сферический сегмент с небольшим изменением кривой в центре в виде самостоятельной выпуклости. Поверхность колонии гладкая, слизистая, с маслянистым блеском, края ровные. Отдельные колонии имеют незначительно выраженные фестончатые края. Некоторые штаммы под продолжительным одно-, двухнедельным – действием дневного света изменяют цвет агаровой среды и придают ей нежно-зеленоватый оттенок.

Свойство спорообразования у бактерий не обнаружено, капсулы образуют. Бактерии можно наблюдать в виде одиночных клеток, парами и реже цепочками. Бактерии кислоустойчивые, грамотрицательны, аэробы или факультативные анаэробы, желатин разжижают медленно, индол и сероводород не образуют, аммиак обнаруживается, гидролиз крахмала наблюдается не всегда и в слабой степени, нитраты редуцируют, на средах Кона и Ушинского не растут или растут очень слабо и только молодые культуры, на среде Ферми растут. На бульонных средах молодые (однодневные) культуры бактерий через сутки вызывают муть, которая частично выпадает в осадок, образуют пленку, но, как правило, пленка появляется на четвертые-пятые сутки. У старых культур такие изменения среды идут медленнее и часто на двадцатые сутки. Молоко свертывают и более или менее пептонизируют, цвет лакмусового молока изменяют. На глюкозе, лактозе, сахарозе и глицерине дают кислоту.

Образование кислоты на глюкозе и сахарозе идет довольно быстро, так что первые признаки обнаруживаются через 12—13 часов, на лактозе и особенно на глицерине этот процесс окисления идет значительно слабее. Через 10—12 суток, а иногда и позже вызывают обратную реакцию и кислую (интенсивно окрашенную) среду, частично или полностью восстанавливают в нейтральную, а глицериновую превращают даже в щелочную. При этом среда обесцвечивается, мутнеет, образуется осадок, на поверхности сплошная зернистая пленка. В процессе обратной реакции на глюкозе и реже лактозе вызывают слабое газообразование. Оптимальная температура для роста бактерий колеблется в пределах 25—28°, однако они хорошо растут на твердой среде, приготовленной на ассимилированном соке яблони при температуре 18—20°.

Микроскопическое исследование зооглей показывает следующее: при увеличении в 25—50 раз зооглеи на фоне хлорофиллоносных наслоений коры выглядят, как и колонии на искусственных средах (в начальный период их роста), росинками, скопления зооглей просматриваются в виде нагромождения бесцветных водянистых пузырьков. С увеличением в тысячу и более раз довольно отчетливо просматриваются детали. Каждый такой пузырек можно сравнить с камерой с очень тонкой, прозрачной оболочкой, наполненной бесцветной жидкостью, насыщенной подвижными микроорганизмами (рис. 17, 18). Еще лучше зооглеи просматриваются окрашенными фуксином Циля. При этом оболочка не окрашивается или слабо окрашивается, бактериальные клетки окрашиваются интенсивно и становятся хорошо видными.

Рис. 17. Микрофотография раскрытий опухоли. Ув. в 100 раз

Рис. 18. Микрофотография зооглей. Ув. в 3000 раз. В зооглеях видны бактериальные клетки

Контроль исследования возбудителя болезни осуществлялся искусственным заражением плодовых растении чистой культурой бактерий, с повторным выделением их из этих же растений после проявления болезни. Заражение плодовых растений выполнялось в различных комбинациях, в разных погодных условиях, в различный вегетационный период и разное время суток.

Для сопоставления вирулентности бактерий, выделенных из пораженных органов разных пород плодовых растений, заражение ими подопытных растений выполнялось одновременно и в одних и тех же условиях. Для этой же цели параллельно ставились опыты с заражением плодовых растений возбудителем болезни, взятым без предварительной изоляции непосредственно, с больных органов растений. В качестве такой культуры бактерий, развившихся в естественных условиях, мы брали свежие, только что образовавшиеся зооглеи с различных наслоений флоэмы или камбия яблони и груши, из которых готовили бактериальную эмульсию для заражения. Надо сказать, что образовавшиеся свежие скопления зооглей, надежно изолированные от внешней среды покровным слоем или другими наслоениями коры, не содержат в себе в эту пору никаких других микроорганизмов и при соблюдении элементарных условий стерильности могут быть взяты для заражения или для лабораторного исследования в чистом виде. Таким образом, среди всех разнообразных штаммов в заражении растений участвовали культуры, выросшие в естественных условиях.

Экспериментальные работы по заражению растений выполнялись непосредственно в саду. Основные работы были выполнены в 1958— 1959 гг. и дополнительно в небольшом объеме в последующие годы. Заражались различные органы плодовых деревьев: листья, завязи плодов, флоэма веток и ветвей. Из опытов выяснилось, что наиболее патогенными были штаммы с гладкой формой колонии, выделенные из яблонь. При заражении этой культурой она вызвала заболевание не только на растение-хозяине и грушах, но и на других, более отдаленных растениях, например, сахалинской вишне.

Выяснено также, что восприимчивость растений к заражению в разный вегетационный период разная. Весной с активизацией сокодвижения чувствительность растений к заражению возрастала, к лету понижалась и к осени, с понижением температуры, она вновь повышалась.

Как показали эксперименты, заметное влияние на развитие болезни оказывают погодные условия. В дождливый период процесс заражения и развитие болезни идет быстрее, чем в солнечные дни, даже в том случае, если места заражении постоянно увлажняются.

При заражении плодов яблони положительные результаты мы получил и лишь в том случае, если оно выполнялось путем оплодотворения цветков, предварительно зараженной пыльцой. Заражение плодиков уколом иглы или инъекцией посредством шприца в большинстве случаев не вызывало заболевания, свойственного естественному развитию болезни. Не заражается также неоплодотворенная завязь. Заражение цветков больной пыльцой через пестики после оплодотворения тоже не вызывает заболевание завязи плодов. Заражение совмещением больного плодика со здоровым не дает положительных результатов. Следовательно, завязи плодов могут заражаться только через половые органы цветков в процессе оплодотворения. Другого пути к заражению, как видно, нет. Этот факт дает возможность направленно вести борьбу с заболеванием завязи. Никакие меры борьбы, применяемые до и после цветения, не могут дать положительных результатов в предотвращении заражения и заболевания завязи плодов.

На примерах заражения коры яблони и груши было установлено, что развитие болезни скорее вызывалось там, где имелись значительные повреждения луба. Поперечные и продольные тонкие надрезы и разрезы и отслаивание коры, когда оно не вызывает расстройства клеток флоэмы, вероятно, не создают достаточно благоприятных условий для развития болезни и при искусственном заражении. Из десяти выполненных таким способом заражений коры яблони только в одном случае болезнь проявилась за короткий промежуток времени (на 20 сутки), а на остальных первые признаки болезни были замечены значительно позже. На пяти ветвях развитие болезни началось через три и четыре месяца, на двух — через год, а два заражения вовсе не вызвали заболевания.

При проверке выяснилось, что болезнь в наиболее короткий срок возникла там, где в процессе отслаивания коры были допущены разрывы тканей. В местах разрывов, где быстро произошло заживание, никаких следов заболевания не отмечалось. Поэтому в дальнейшем при заражении мы преднамеренно нарушали цельность клеток и разъединяли послойно ткани флоэмы, после чего в расслоения вводили бактериальную эмульсию. Из пяти зараженных таким образом ветвей яблони на четырех из них болезнь проявилась на 15—20 сутки, а на одной, где через пять дней после заражения была снята повязка, инкубационный период удлинился до 40 дней. У контрольных заражений, которые были выполнены одновременно на тех же ветвях одними и теми же штаммами, но прежним методом (без повреждений волокон коры, если не иметь в виду продольный разрез ее), первоначальные признаки появились только на четвертый месяц, а на зараженном участке, где через пять дней была снята повязка, заболевание вообще не возникло.

Приближая исследования к условиям, которые имеют место при естественном заражении, мы выполнили еще ряд экспериментов, где само заражение осуществлялось естественным порядком. Эксперименты преднамеренно ставились в период активного развития болезни, которое всегда совпадает с интенсивным сокодвижением плодовых деревьев и проявляется на пораженных участках коры в виде истечения экссудата. На пути стекающих капель экссудата делалось четыре разных разреза коры без соблюдения какой-либо последовательности и мер предосторожности с точки зрения стерильности.

Из четырех разрезов два выполнялись поперек, а два вдоль волокон, из которых один продольный разрез выполнялся с отслаиванием коры. Для того, чтобы вызвать заметное повреждение волокон ткани флоэмы, один поперечный разрез был сделан пилкой с большим разводом, все другие разрезы делались острым скальпелем и оставались открытыми. Все это выполнялось в сырую и дождливую погоду, с тем чтобы растворенный каплями дождя экссудат мог сразу (до срастания коры) попасть в места ранений. Из пяти выполненных таким образом экспериментов заражение коры, как и прежде, наблюдалось раньше всего там, где было допущено более сильное, по сравнению с порезами, повреждение волокон тканей. В местах разрезов кора не была поражена. На участках ветвей, где отслаивалась кора, только в одном случае через 13 месяцев заражение вызвало заболевание. Следовательно, заболевание ветвей возникает скорее в том случае, если они ранее уже имели более или менее серьезные повреждения коры. В ранениях, где быстро идет заживление, что бывает при порезах, разрезах, заражение можно вызвать лишь в том случае, если в этих местах создать постоянно влажные условия. Однако и эти меры не всегда дают положительные результаты, и заражения, как мы убедились, в большинстве случаев не наблюдается.

В последнем также можно убедиться и на других примерах, которые имеют место при выполнении прививок и особенно при окулировке, где подобные повреждения коры вызываются необходимостью самой операции. Несмотря на то, что в процессе работ, связанных с прививкой плодовых растений, не соблюдаются даже элементарные правила гигиены, тем не менее из всей массы прививок заражается не более двух процентов. Таким образом, повреждения в виде порезов и отслаивание коры, когда последнее не вызывает серьезного расстройства волокон тканей, не представляет какой-либо опасности для заражения.

При повреждениях, где имеет место разрушение клеток, заражение тканей идет быстро. Здесь в отличие от порезов возникают более глубокие физиологические изменения в клетках. Часть клеток по периферии ранения постепенно ослабевает, а поврежденные сосуды в силу того, что они не сразу теряют проводящую способность, вызывают в местах ранения приток жидкости и этим создают там влажную, благоприятную для заражения среду. В ходе развития болезни возбудитель легко проникает в ослабленные клетки, разрушает их и вызывает, но уже с нарастающей силой, ослабление других клеток. Этот процесс длится до тех пор, пока не произойдет полное поражение всех живых тканей коры ветви.

В естественных условиях наиболее частой (основной) причиной заболевания ветвей являются пораженные плодовые и обрастающие ветви. Этим и объясняется то, что гибель деревьев в большинстве случаев начинается с отмирания мелких веток и лишь в процессе дальнейшего развития болезни она переходит на более крупные и основные ветви.

Еще быстрее болезнь начинает развиваться при заражении через торец отпиленных и незащищенных ветвей. Это наблюдается и в естественных условиях. Оставленные без соответствующей обработки торцы ветвей, как правило, заболевают все. Перекусанные зеленые побеги яблони жучком (стригун-долгоносик) также заражаются почти все. Заболевают такие побеги, в большинстве случаев, весной следующего года, что приводит к гибели всего прироста, а часто и всего побега.

Эксперименты по перекрестному заражению яблони и груши показывают, что в большинстве они взаимно заражаются, однако развитие болезни па грушах, в том числе и при заражении культурой, выделенной из растения хозяина, протекает медленнее, чем на яблони. К тому же развитие болезни на грушах в летний период приостанавливается и до конца вегетационного сезона, как правило, не возобновляется. Вторичное проявление болезни наблюдается через год.

Принято считать исследование болезни растений сугубо сезонной работой, однако в некоторых случаях ее можно с успехом вести в любой лаборатории без горшечных (окоренных) плодовых культур и в зимний сезон, включая опыты с заражением, которые мы практикуем подряд несколько лет. Для этого следует в определенное время срезать с плодового дерева несколько здоровых (без каких-либо признаков поражения) ветвей в возрасте не менее трех-четырех лет и несколько ветвей такого же возраста, но пораженных заболеванием. Куски длиной 50—60 см таких веток сажают в горшок с влажной землей и периодически поливают, не давая земле подсохнуть. Через 20—25 дней посаженные ветви дают (не окореняясь) рост побегов и листьев. В отличие от горшечных растений, имеющих корни, развитие побегов у таких ветвей идет слабее и сами ветви ослаблены. В таком состоянии они более восприимчивы к заболеванию и заражаются легче, чем на деревьях.

Больные куски веток не высаживают в горшок, а обматывают влажным полотном и укладывают в затененное место. На протяжении всего времени до явного, отчетливо выраженного проявления болезни полотно необходимо систематически увлажнять, не допуская высыхания.

Болезнь на больной ветви начинает развиваться через 10—12 дней, что можно распознать по хорошо заметным опухолям. Из таких опухолей можно легко выделить возбудитель болезни и заразить листья, зеленые побеги и кору здоровых ветвей.

Посаженные в горшки куски здоровых ветвей следует ставить в затененное место с таким расчетом, чтобы на них падал только рассеивающий свет, так как прямые, отраженные от стекла солнечные лучи отрицательно сказываются на их развитии.

Предлагаемый метод исследования болезни, на наш взгляд, заслуживает внимания, так как он дает возможность вести эту работу круглогодично.